您好,欢迎访问安徽快三官网【真.博娱】!
行业动态

聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)

  聚丙烯酰胺(polyacrylamide,PAA)凝胶是丙烯酰胺(acry—lamide,Acr),在交联剂甲叉双丙烯酰胺(bisacrylamide,Bis)的作用下经聚合而形成的一种大分子化合物。

  Acr的聚合作用只有在自由基存在时才能发生,需要一个催化诱发剂系统产生自由基,过硫酸铵—TEMED(四甲基乙二胺)和核黄素—TEMED就是这样的催化诱发系统。前者发生化学聚合作用,后者发生光致聚合作用。化学聚合时诱发剂TEMED加速过硫酸铵形成自由基,使Acr单体转变为自由基态而导致聚合作用。溶液的pH对聚合作用是重要的,因为过低pH没有足够的碱基加速催化反应,同样过多的氧分子存在,会使聚合作用很快停止。所以制备凝胶时,在加过硫酸铵之前,混合物必须抽去空气。核黄素催化的聚合作用,常用于制备浓缩胶,因为这样制得的凝胶孔度要大些。核黄素在光照射下及有微量氧存在时,产生自由基使Acr发生聚合作用。

  PAGE通常包括两种孔度的凝胶,即大孔度的浓缩胶和小孔度的分离胶,浓缩胶的浓度通常PAA量为4.5%,交联剂含量为2.5%。分离胶的浓度则因样品的分子量而不同,高浓度常用于分离低分子量蛋白质。PAA量为7.5%的分离胶,对大多数生物体内的蛋白质的分离能有满意的结果。

  电泳的支持物凝胶一般制备在玻璃管中或玻璃板上,所用玻璃管一般为8梍12cm长,内径5梍8mm。进行电泳的电泳槽分上槽和下槽,两个相互分离的部分,各装有电极,通过玻璃管中的凝胶,使它们连成导电的整体(图42)。电泳时带有电荷的分子在电场作用下发生移动,移动的速度依赖于电场的强度、分子的净电荷以及分子的大小和形状,同时也取决于介质的离子强度、粘度和温度。由于PAA凝胶具有三维网状结构,能起分子筛效应,用它作为电泳支持物,把分子筛效应和电荷效应结合起来,达到了很好的分离效果,而且方法也简单、快速,是植物生理生化研究中常用的方法。

  K.蛋白质染色液:考玛斯蓝G─250 200mg,甲醇100ml,冰醋酸20ml,蒸馏水80ml,溶解后混合之。

  抗坏血酸70.4mg,联苯胺溶液20ml(2g联苯胺溶于18ml用文火加热的冰醋酸中,再加蒸馏水72ml),0.6%过氧化氢20ml,蒸馏水60ml。

  (1)分离胶:按A∶C∶H∶水=1∶2∶4∶1的比例,先将贮备液A,C和水放在一小烧杯中,贮备液H放在另一小烧杯中,一起放在真空干燥器中,用线分钟,取出将H并入,用玻棒轻轻搅动使之混合,立即注于干洁的玻管中。玻管的底部要密封,并垂直放置,用滴管吸取混合液,沿管壁注入,注意不要进入气泡。胶液注到离管口2cm处,立即在其表面覆盖少量蒸馏水,静置1小时左右,当见到水层下面有一清晰的界面时,则表明胶已聚合凝固,用吸水纸小心吸去上面水层。

  (2)浓缩胶:按B∶D∶E∶F=1∶2∶1∶4的比例,同上法制备浓缩胶,加到已凝固的分离胶上面,高度约1cm,同样覆盖一层蒸馏水。置于日光灯下照光约1小时,直至凝固,吸去上面水层,待用。

  (1)取贮备缓冲液G─200ml,加预冷的蒸馏水1800ml,稀释10倍,取1000ml倒在电泳槽的下槽。

  (3)取实验89中经硫酸铵分级沉淀的过氧化物酶透析液,用取样器于每管的胶面上加入样品100μl(含蛋白质50─100μg,如浓度过稀,可把酶液装在透析袋中,用蔗糖浓缩),然后用稀释的溶液G,小心地将每管充满。

  (4)在电泳槽的上槽同样倒入稀释10倍的缓冲液G,缓冲液中加入1ml溴酚蓝溶液I。

  (5)连接好导线,将上槽接到电泳仪的(─)极,下槽接( )极。开启电泳仪电源,调节输出电流,使每管电流强度为2mA,通电15分钟。然后增加电流使每管达5mA,大约经过2─3小时,直至管中的染料迁移到离管底5mm左右,停止通电,结束电泳,取下胶管。

  (1)取50ml注射器灌满水,配上6号长针头,将针头插入胶与管壁之间,一边注水一边将针头向前推进,直至把凝胶从管中脱出。如果凝胶还不能脱出,可用洗耳球从管口上端压入空气,促使凝胶自管内脱出。

  (2)将胶分成二组,一组用考玛斯蓝G─250进行蛋白质染色;另一组置于过氧化物酶染色液甲或乙中进行染色。

  (3)取出经过染色的凝胶,用水冲洗数次,然后置于脱色溶液J中进行脱色,除去凝胶的本底颜色,使色带更为清晰。

  G.电极缓冲液:31.2gβ—丙氨酸,冰醋酸8ml,加蒸馏水配成1000ml,pH4.5。

  I.0.1%碱性品红(Basic fuchsin)水溶液,用作电泳指示染料。

  电极缓冲液G不必稀释,直接加在上、下槽中,注意上槽应接电泳仪( )极,下槽接(─)极,以碱性品红染料作指示剂,其他所有操作同上。

  注:本实验所用药品Acr,联苯胺,联茴香胺对人体有毒性,防止接触皮肤及吸入。

联系方式
安徽快三官网【真.博娱】
联系人:王经理
联系电话:18137878766
邮箱:766074261@qq.com
地址:邓州市 夹津口镇公川村3组2号
微信
Copyright ©2015-2020 安徽快三官网【真.博娱】 版权所有 安徽快三保留一切权力!