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聚丙烯酰胺凝胶电泳原理

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  聚丙烯酰胺凝胶电泳原理:聚丙烯酰胺凝胶电泳简称为 PAGE(Polyacrylamide gel electrophoresis),是以聚丙烯酰胺凝胶作为 支 持 介 质 。 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 是 由 单 体 的 丙 烯 酰 胺 ( CH2=CHCONH2 Acrylamide ) 和 甲 叉 双 丙 烯 酰 胺 ( CH2(NHCOHC=CH2)2 N,N’-methylenebisacrylamide)聚合而成,这一聚合过程需要有自由基催化完成。常用的催化聚合方法有两种:化学聚合和光聚合。 化学聚合通常是加入催化剂过硫酸铵(AP)以及加速剂四甲基乙二胺(TEMED),四甲基乙二胺催化过硫酸铵产生自由基。溶液的 pH 对 聚合作用是重要的,因为过低 pH 没有足够的碱基加速催化反应,同样过多的氧分子存在,会使聚合作用很快停止。所以制备凝胶时,在 加过硫酸铵之前,混合物必须抽去空气。核黄素催化的聚合作用,常用于制备浓缩胶,安徽快三,因为这样制得的凝胶孔度要大些。核黄素在光照 射下及有微量氧存在时,产生自由基使 Acr 发生聚合作用。 聚丙烯酰胺凝胶的孔径可以通过改变丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺的浓度来控制,丙烯酰胺的浓度可以在 3%-30%之间。低浓度的 凝胶具有较大的孔径,如 3%的聚丙烯酰胺凝胶对蛋白质没有明显的阻碍作用,可用于平板等电聚焦或 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的浓缩 胶,也可以用于分离 DNA;高浓度凝胶具有较小的孔径,对蛋白质有分子筛的作用,可以用于根据蛋白质的分子量进行分离的电泳中,如 10%-20%的凝胶常用于 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的分离胶。选择 T 和 C 的经验公式是: = 6.5-0.3T 此式可用于计算 T 为 5%~20% C 时的凝胶组成。C 值并不很严格,在大多数情况下,可变化的范围约为 1%,当 C 保持恒定时,凝胶的有效孔径随着 T 的增加而减小,当 T 保持恒定,C 为 4%时,有效孔径最小,C 大于或小于 4%时,有效孔径均变大,C 大于 5%时凝胶变脆,不宜使用,实验中最常用的 C 是 2.6%和 3%。 6 ] p/ ^/ w: H+ e a 由于聚丙烯酰胺凝胶有突出的优点,因而四十年来得到广泛的应用,目前尚无更好的支持介质能够取代它。其主要的优点有: 1、 可以随意控制胶浓度“T”和交联度“C”,从而得到不同的有效孔径,用于分离不同分子量的生物大分子。 2、 能把分子筛作用和电荷效应结合在同一方法中,达到更高的灵敏度:10-9 ~10-12mol/L。 3、 由于聚丙烯酰胺凝胶是由-C-C-键结合的酰胺多聚物,侧链只有不活泼的酰胺基-CO-NH2,没有带电的其他离子基团,化学 惰性好,电泳时不会产生“电渗”。 4、 由于可以制得高纯度的单体原料,因而电泳分离的重复性好。 5、 透明度好,便于照相和复印。机械强度好,有弹性,不易碎,便于操作和保存。 6、 无紫外吸收,不染色就可以用于紫外波长的凝胶扫描作定量分析。 7、 还可以用作固定化酶的惰性载体。 ( x%

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