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安徽快三聚丙烯酰胺凝胶电泳实验分析

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  聚丙烯酰胺凝胶电泳实验分析 在很多地方看到大家都在讨论关于聚丙烯酰胺凝胶电泳的知识。安徽快三看了好多观点以后,不如自己做一个实验 来分析。更何况对于聚丙烯酰胺凝胶电泳分析必须要通过实验来验证观点。下面就是关于聚丙烯酰胺凝胶 电泳实验分析: 明确实验目的:掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理。 2.熟悉聚丙烯酰胺凝胶电泳的操作过程。 3.了解聚丙烯酰胺凝胶电泳的特点和应用范围。 了解实验原理: 聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺(简称 Acr)和交联剂甲叉双丙烯酰胺(简称 Bis)在催化剂的作用下,聚合 交联而成的含有酰胺基侧链的脂肪族大分子化合物。 聚丙烯酰胺凝胶具有三维网状结构,能起分子筛作用。用它作电泳支持物,对样品的分离取决于各组分所 带电荷的多少及分子大小。此外,聚丙烯酰胺凝胶电泳还具有浓缩效应,即在电泳开始阶段,由于不连续 pH 梯度作用,将样品压缩成一条狭窄区带,从而提高了分离效果。 聚丙烯酰胺凝胶电泳分为垂直平板电泳和圆盘电泳,两者的原理完全相同。由于垂直板形凝胶具有板薄、 易冷却,分辨率高、操作简单、便于比较与扫描等优点,因而为大多数实验室采用。聚丙烯酰胺凝胶电泳 的分辨率比纸电泳高得多,能检出 10-9~10-12g 样品,特别适合于分离和测定蛋白质、核酸等生物大分 子化合物。它除了能对生物大分子物质进行定性、定量分析外,还可用以测定分子量,且是一种较先进的 测定分子量的方法。 不连续变性聚丙烯酰胺凝胶电泳是使用最广泛的凝胶电泳。不连续是指电泳的 pH 值不连续(样品浓缩胶 缓冲液 pH 6.8, 电极缓冲液 pH 8.3, 分离胶 pH 8.8)、凝胶不连续(一般分成样品浓缩胶和样品分离胶 两层)。变性是指样品蛋白经 SDS 和巯基乙醇作用后,所有蛋白质都解聚成为其构成亚基,并且都带上负 电荷,形状都近似于长椭园棒状。这种 SDS-蛋白质复合物,在凝胶电泳中的迁移率,不再受蛋白质原有 电荷和形状的影响,而只与园棒的长度也就是蛋白质的分子量有关。 SDS 聚丙烯酰胺凝胶的有效分离笵围取决于灌制凝胶时聚丙烯酰胺的浓度和交联度, 二者决定凝胶分子筛 的孔径大小,而孔径又是灌胶时所用丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺绝对浓度的函数。用 5~15%的丙烯酰胺 所灌制凝胶的线性分离范围如下表: SDS 聚丙烯酰胺凝胶的有效分离范围(*双丙烯酰胺~丙烯酰胺摩尔比为 1:29) *丙烯酰胺浓度(%) 线 实验准备: 一、器材 1.垂直平板电泳仪全套。 2.刻度吸管、安徽快三,三角烧瓶、加样枪等。 二、试剂 1.30%丙烯酰胺/N, N’-亚甲双丙烯酰胺 以温热去离子水配制成含 29%(w/v)丙烯酰胺和 1%(w/v) N, N’-亚甲双丙烯酰胺的贮存液,过滤后入棕色瓶中置 4oC 冰箱贮存。丙烯酰胺和双丙烯酰胺在贮存过程 中会在光催化或碱催化下缓慢转变为丙烯酸和双丙烯酸,故溶液的 pH 值不亦超过 7.0,且应免光保存。 一般在棕色瓶、4oC 冰箱条件下可保存数月。 小心:丙烯酰胺和双丙烯酰胺具有很强的神经毒性并容易吸附于皮肤。 2.十二烷基硫酸钠(SDS) SDS 可用去离子水配成 10%(w/v)贮存液于室温保存。 3.TEMED(N,N,N’,N’-四甲基乙二胺) TEMED 通过催化过硫酸铵形成自由基而加速丙烯酰胺与双丙烯酰 胺的聚合,TEMED 原液可在 4oC 冰箱保存。 4、10%过硫酸铵 过硫酸铵提供驱动丙烯酰胺和双丙烯酰胺聚合所必需的自由基。 注意:10%过硫酸铵必须新鲜配制,现用现配。 5.4×1.5mol/L Tris(pH8.8)贮存液(稀释 4 倍即为分离胶缓冲液) 在 300ml 去离子水中溶解 91g Tris 碱(3mol/L),用 1mol/L HCl 调 pH 至 8.8,加去离子水定溶至 500ml,滤纸过滤后置 40 冰箱保存。 6.4×1 mol/L Tris(pH6.8)贮存液(稀释 4 倍即为浓缩胶缓冲液) 在 40ml 去离子水中溶解 6.05g Tris 碱(0.5mol/L),用 1mol/L HCl 调 pH 至 6.8,加去离子水定溶 至 100ml,滤纸过滤后置 40 冰箱保存。 7.5×Tris-甘氨酸电泳缓冲液贮存液(稀释 5 倍即为 Tris-甘氨酸电泳缓冲液) 在 900ml 去离子水中溶解 15.1g Tris 碱和 94g 甘氨酸,然后加入 50ml 10%(w/v)电泳级 SDS 贮存 液,用去离子水定溶至 1000ml。 8.2×SDS 凝胶加样缓冲液 100mmol/L Tris-HCl(pH 6.8) 200 mmol/L DTT(二硫苏糖醇)或 10% 巯基乙醇 4% SDS 9.染色液 在 90ml 甲醇:水(1:1,w/v)和 10ml 冰醋酸混合液中溶解 0.25g 考马斯亮蓝 R250,用 Whatmman 1 号滤纸过滤后室温保存。 10.脱色液 实验步骤: 1.配制 SDS 聚丙烯酰胺凝胶所需的各种试剂(见试剂部分) 2.分离胶的灌制 (1)根据厂家说明书安装好玻璃板和电泳槽。(2)竖直电泳槽,用融化的 1%琼脂封住电泳槽的缝隙。 (3) 确定所需分离胶溶液的体积, 按下表给出的数值在一小烧杯中按所需丙烯酰胺浓度配制一定体积的分 离胶溶液。配胶且寸先加其它试剂,再加过硫酸胺,最后加 TEMED。一旦加入 TEMED 后,立即快速旋 动混合物并进入下一步制胶操作。 总体积 5ml 总体积 10ml 总体积 15ml 总体积 20ml 总体积 25ml 总体积 30ml 30% 甲醇+10% 冰醋酸+60%H2O2 0.2% 溴酚蓝 20%甘油 溶液成分 凝胶浓度 8%: 水 30%丙烯酰胺 1.5M Tris (pH 8.8) 10% SDS 10%过硫酸胺 2.3ml 1.3ml 1.3ml 0.05ml 0.05ml 4.6ml 2.7ml 2.5ml 0.1ml 0.1ml 6.9ml 4.0ml 3.8ml 0.15ml 0.15ml 9.3ml 5.3ml 5.0ml 0.2ml 0.2ml 11.5ml 6.7ml 6.3ml 0.25ml 0.25ml 13.9ml 8.0ml 7.5ml 0.3ml 0.3ml TEMED 凝胶浓度 10%: 水 30%丙烯酰胺 1.5M Tris (pH 8.8) 10% SDS 10%过硫酸胺 TEMED 0.003ml 0.006ml 0.009ml 0.012ml 0.015ml 0.018ml 1.9ml 1.7ml 1.3ml 0.05ml 0.05ml 0.002ml 4.0ml 3.3ml 2.5ml 0.1ml 0.1ml 0.004ml 5.9ml 5.0ml 3.8ml 0.15ml 0.15ml 0.006ml 7.9ml 6.7ml 5.0ml 0.2ml 0.2ml 0.008ml 9.9ml 8.3ml 6.3ml 0.25ml 0.25ml 0.01ml 11.9ml 10.0ml 7.5ml 0.3ml 0.3ml 0.012ml (4)迅速在两玻璃板间隙中灌注丙烯酰胺混合溶液,留出灌注浓缩胶所需空间(梳子的齿长再加 0.5cm)。 再在胶液面上小心注入一层水(约 1~2mm 高),以阻止氧气进入凝胶溶液,加速凝胶形成。 (5)分离胶聚合完成后(约 30 分钟),倾出覆盖水层,用滤纸吸净残余水分,再进行下一步浓缩胶的制 备。 3.浓缩胶的灌制 (1)按下表给出的数据,在另一小烧杯中制备一定体积及一定浓度的丙烯酰胺溶液,一旦加入 TEMED, 马上开始聚合,故应立即快速旋动混合物并进入下步操作。 配制Tris-甘氨酸 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 5% 浓缩胶溶液 溶液成分 水 30%丙烯酰胺 1MTris(pH 6.8) 10% SDS 10%过硫酸胺 TEMED 总体积 3ml 总体积 4ml 总体积 5ml 总体积 6ml 总体积 8ml 2.1ml 0.5ml 0.38ml 0.03ml 0.03ml 0.003ml 2.7ml 0.67ml 0.5ml 0.04ml 0.04ml 0.004ml 3.4ml 0.83ml 0.63ml 0.05ml 0.05ml 0.005ml 4.1ml 1.0ml 0.75ml 0.06ml 0.06ml 0.006ml 5.5ml 1.3ml 1.0ml 0.08ml 0.08ml 0.008ml (1)在聚合的分离胶上直接灌注浓缩胶,并立即在浓缩胶溶液中插入干净的梳子。小心避免混入气泡,再 加入浓缩胶溶液以充满梳子之间的空隙,将凝胶垂直放置于室温下。 (2)浓缩胶聚合完成后(30 分钟),小心移出梳子。把凝胶固定于电泳装置上,上下槽各加入 Tris-甘 氨酸电极缓冲液。 4.样品制备 取 0.5ml 稀释血清(血清用 H2O2 稀释一倍)加入 0.5ml 2×SDS 凝胶加样缓冲液混匀,在 100℃水浴 中加热 3 分钟使蛋白质变性。10,000rpm 离心 1 分钟,取上清加样。 5.加样及电泳 用长皮头吸嘴吸取处样品 50μl,从加样孔底部缓慢加样。 注意:加样时不得插伤凝胶孔胶面,不得产生气泡、样品不得溢出加样孔。 6.接电源与电泳 上槽接负极,下槽接正极。调节电压至 80V 电泳至样品前沿刚好进入分离胶后,把电压提高到 120V(凝 胶上所加电压约为 8V/cm),继续电泳直至溴酚蓝到达分离胶底部上方约 1cm(约 2—3 小时),然后 关闭电源,取出插头。 7.取胶 从电泳装置上御下玻璃,用水果刀撬开玻璃板。并用刀在紧靠最左边一孔凝胶下部切去一角以标 注凝胶的方位。 8.染色与脱色 用考马斯亮蓝染液对 SDS 聚丙烯酰胺凝胶进行室温染色 1~2 小时后,用脱色液在脱色摇床上脱色 3~4 次,每次 20~30 分钟。 血清蛋白经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离可以产生十多条色带。 实验注意事项 1.丙烯酰胺和双丙烯酰胺具有很强的神经毒性并容易吸附于皮肤,操作时应免避沾在脸、手等皮肤上。最 好戴一次性塑料手套操作。 2.过硫酸铵的主要作用是提供自由基引发丙烯酰胺和双丙烯酰胺的聚合反应,故一定要新鲜,贮存过久的 过硫酸铵商品不能使用。此外,10%过硫酸铵必须现用现配,4OC 冰箱贮存不超过 48 小时。 3.灌制凝胶时,应避免产生汽泡,因为汽泡会影响电泳分离效果。 4.刚灌注分离胶混合溶液后,应在分离胶液面上加 1~2cm 高的水层,以阻隔空气。胶液面上加水层时要 特别小心,缓缓叠加,以免冲坏凝胶的胶面。 5.聚丙烯酰胺凝胶电泳耗时长,电泳过程中产热多,特别是夏天产热更多。故电泳过程中应安装循环冷却 水以带走热量,或在 4OC 冰箱中电泳。 思考题: 1.简述血清蛋白聚丙烯酰胺电泳的原理和特点。 2.简述本实验的注意事项。 3.简述聚丙烯酰胺电泳的操作要点

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